單細胞RNA測序（scRNA-seq）可通過轉錄譜分析發育、再生、衰老、以及疾病發生過程中的細胞和分子機制。然而，目前大多數的定量方法局限在基因水平，無法區分具有不同結構和功能的轉錄異構體的差異表達。
最近，我校中山眼科中心劉奕志和胡友金團隊開發了一種低成本、高效的新型單細胞測序技術scRCAT-seq，并應用于分析人視網膜發育的細胞圖譜，發現視網膜干細胞的分化及細胞命運決定過程中TSS和TES的變化規律。研究成果于2020年10月13日，在Nature Communications在線發表論文“Single-cell RNA cap and tail sequencing (scRCAT-seq) reveals subtype-specific isoforms differing in transcript demarcation”。
結合轉錄本首尾捕獲和機器學習系統分析TSS和TES
在此研究中，scRCAT-seq通過對單細胞全長cDNA的5’及3’進行靶向捕獲，基于常規的短讀長測序平臺進行測序（圖1），結合隨機森林（random forest, RF）等機器學習算法獲得高準確性的TSS和TES（圖2）。與已報道的測序方法進行比較，scRCAT-seq可顯著提高所鑒定TSSs/TESs的準確性4-5倍。
圖1：scRCAT-seq的實驗流程示意圖
圖2：機器學習算法顯著提高所鑒定TSSs/TESs的準確性
ScRCAT-seq具有低成本、高效率的特點
與已有的全長轉錄本測序方法Smart-seq2和ScISOr-seq相比，scRCAT-seq具有成本低，效率高等特點。以相同的成本，scRCAT-seq所能檢測的轉錄本數量是ScISOr-seq的7倍（圖3），scRCAT-seq能檢測到大量ScISOr-seq所不能檢測到的低表達的基因。
圖3：scRCAT-seq具有高效率、低成本的特點
scRCAT-seq的可適性強
scRCAT-seq適用于分析不同物種來源、不同細胞類型和數量的樣品，進行細胞分群，細胞類型特異的轉錄本鑒定，穩定性好，并可在不同物種和細胞中標注新的轉錄本，豐富現有標注RNA轉錄本的數據庫。scRCAT-seq可與單細胞三代測序技術，或者sanger測序技術結合，對全長轉錄本的結構，特別是內在外顯子進行進一步鑒定。
應用于分析人視網膜發育過程中轉錄組TSS和TES的動態變化
以人胚胎干細胞來源的視網膜類器官為研究對象，通過對10571個單細胞進行測序分析，該研究描繪了視網膜祖細胞（RPC）向光感受器前體細胞（PR precursors），進一步向視錐細胞（cone）分化的轉錄異構體的表達圖譜，發現轉錄異構體變化最顯著的時間點發生在RPC向光感受器前體細胞轉變的節點。該研究還發現CCND1異構體可能通過調節細胞周期，介導RPC向光感受器前體細胞的命運轉換（圖4）。
圖4：人類視錐細胞發育過程中RNA異構體的動態變化
