中大新聞網訊（通訊員田國寶）抗生素的發(fā)現(xiàn)是20世紀醫(yī)學史上最輝煌的成就之一。然而，隨著抗生素大量和無序使用，抗生素耐藥問題則已成為21世紀人類不得不面對的嚴峻挑戰(zhàn)。抗生素耐藥問題不僅是困擾臨床的一大難題，“超級耐藥細菌”的不斷出現(xiàn)更是引起公眾的極大恐慌，成為全球普遍關注的公共生物安全問題。從遺傳學角度，耐藥性的產生是細菌為應對環(huán)境變化，尤其是抗生素選擇壓力下進化的產物。在進化歷程中，抗生素耐藥基因的每個核苷酸位點都可能發(fā)生突變，有些突變使細菌對抗生素更敏感，有些會導致更耐藥。在抗生素選擇壓力下，更耐藥的突變類型會更容易被篩選出來，并引起逐步擴散和傳播。
2022年4月29日，中山大學中山醫(yī)學院陳小舒教授、楊建榮教授和田國寶教授合作研究團隊在Molecular Biology and Evolution在線發(fā)表題為“Prediction of Antibiotic Resistance Evolution by Growth Measurement of All Proximal Mutants of Beta-Lactamase”的研究論文。該工作以臨床廣泛流行的超廣譜β-內酰胺酶耐藥基因blaCTX-M為研究模型，構建了包含blaCTX-M所有單點突變基因型的大腸桿菌克隆文庫，結合高通量測序和神經網絡模型實現(xiàn)了對耐藥基因進化的溯源和前瞻性預測。
研究團隊利用混雜引物、以Fusion PCR的方法在耐藥基因中引入突變，構建包含所有單堿基突變的等位基因庫，同時每個基因型均帶有隨機的條形碼。為了確保突變基因型在每個細胞中拷貝數(shù)一致，作者建立了一套高效的整合系統(tǒng)，將突變基因型整合到大腸桿菌MG1655的attHK022位點，最終獲得了等位基因突變體庫，并通過三代測序技術獲得基因型與條形碼的對應關系。結合藥物篩選和二代測序技術，測定每個基因型在不同藥物濃度下的相對生長值（Relative growth），并繪制了相應的適應度景觀（Fitness landscape）。有意思的是，部分位點，如P167、L169、E166，發(fā)生突變將顯著提高大腸桿菌的相對生長值和MIC值，而這些突變體的主要富集在超廣譜β-內酰胺酶CTX-M的活性中心（圖1）。
圖1. 抗生素耐藥基因進化適應度景觀的建立
研究團隊進一步以適應度景觀為基礎，分別建立了前瞻性預測模型（PEARP）和回顧性溯源模型（PEARR）。PEARP模型可用于預測新的突變基因型是否耐藥，其AUC為0.928。模型預測為耐藥的基因型（包括單點、雙點、三點、四點突變基因型）顯著富集于臨床分離到的基因型。PEARR模型可用于回顧性預測耐藥基因的進化軌跡，且其預測的進化軌跡在SSWM（Strong-Selection-Weak-Mutation）模型下與獨立的藥敏實驗的結果相符（圖2）。
圖2：抗生素耐藥基因進化的回顧性溯源和前瞻性預測模型
綜上所述，研究團隊開發(fā)的高通量平臺可用于精準預測抗生素耐藥基因的進化軌跡、輔助抗菌藥物設計和指導藥物使用，為臨床抗生素耐藥性防控提供有力支撐。
中山大學中山醫(yī)學院副研究員馮思源、博士研究生吳卓幸、梁婉菲為論文共同第一作者，陳小舒教授、楊建榮教授和田國寶教授為論文通訊作者。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/molbev/msac086
